笔记百科血细胞计数板
详谈血细胞计数板使用方法
1 血球计数板的构造
血细胞计数板是一块特制的厚型载玻片，玻片中有4 条凹槽，构成了3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面各有一个方格网，即计数区，计数区被分成9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，如图1。故每一块血细胞计数板中间平台上有2个计数室。
图1 血细胞计数板（左）；16×25规格的计数室（右）
2 血球计数板的规格
酵母菌数量动态变化探究活动中苏教版推荐使用规格为1mm×1mm×0.1mm的血球计数板；人教版、浙科版高中生物教材推荐使用规格为2mm×2mm×0.1mm的血球计数板。前者在实验活动中更为常见。这两种技术室的容积分别为0.1mm3（1×10-4mL）和0.4mm3（4×10-4mL）。每种规格的计数室通常又有两种规格：一种是16×25 型，即大方格内分为16个中格，每一中格又分为 25小格；另一种是25×16 型，即大方格内分为 25中格 ，每一中格又分为 16 小格。但是，不管计数室是哪一种型号规格 ，计数室都是由400个小方格组成（如图2）。 图2 两种规格的计数室放大后的图像
3 加样
血球计数板的结构及原理与普通的载玻片不同，因此加样及盖盖玻片也有特定的操作要求，人教版教材建议：“先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取培养液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入，多余的培养液用滤纸吸去。”浙科版必修三中却描述为：“用滴管从试管中取1滴培养液到血细胞计数板的方格区，盖上盖玻片[1]”。浙科版学生实验手册中的操作方法与人教版的描述一致[2]。其实不论是先加样后盖盖玻片，还是盖盖玻片再加样，理论上都行的通，但是对前者的液滴量的要求较高，盖盖玻片时也容易产生气泡。因此为了更准确地计数及成功率角度方面说，应先盖盖玻片再加样。4 血球计数板的计数
4.1 用1mm×1mm×0.1mm，16×25规格或25×16的计数室 加样后，稍待片刻，待细胞全部沉降到技术室底部后，将计数板放于载物台中央，寻找技术室，取计数室的左上、右上、右下、左下4个中格（即对应图2中1、4、16、13四个中格，共计100个小格）进行计数。计数重复3次，算出每个小格内细胞数目的平均值。计算公式为：细胞个数/1mL=100个小方格细胞数×400×104×稀释倍数；若用1mm×1mm×0.1mm，25×16规格的计数室 ，加样后，在计数室的左上、右上、右下、左下和中部的5个中格（即对应图2中1、5、25、21、13五个中格，共计80个小格子）进行计数。计数重复3次，算出每个小格内细胞数目的平均值。计算公式为：细胞个数/1mL=每个小格内细胞的平均值×400×104×稀释倍数（公式推导如图3）4.2 用2mm×2mm×0.1mm，16×25或25×16规格的计数室 加样后，稍待片刻，待细胞全部沉降到技术室底部后，将计数板放于载物台中央，寻找技术室，取计数室的左上、右上、右下、左下4个中格（即对应图2中1、4、16、13四个中格，共计100个小格）进行计数。计数重复3次，算出每个小格内细胞数目的平均值。计算公式为：细胞个数/1mL=每个小格内细胞数目的平均值×400×2.5×103×稀释倍数；若用2mm×2mm×0.1mm，25×16规格的计数室 ，加样后，在计数室的左上、右上、右下、左下和中部的5个中格（即对应图2中1、5、25、21、13五个中格，共计80个小格子）进行计数。计数重复3次，算出每个小格内细胞数目的平均值。计算公式为：细胞个数/1mL=每个小方格细胞数目的平均值×400×2.5×103×稀释倍数（公式推导如图3）
图3 1mL内细胞个数的推导公式
备注：上述公式推导中，每个小格内细胞平均数是指：16×25规格通过100个小格计算出的每个小格内细胞平均数；或25×16规格，通过80个小格计算出的每个小格细胞平均数。
5 典型例题
在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，利用1mm×1mm×0.1mm，25×16规格计数板对微生物细胞进行直接计数，如下图。某同学操作时将1mL 酵母菌样品加 99mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。回答下列问题：
（1）在实验中，某学生的部分实验操作过程是这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请指出该同学实验操作中的 3 处错误并改正：①应将试管轻轻震荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数；②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养；③应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据。
（2）在实验前应该对计数板、吸管等器具进行灭菌处理。
（3）如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是稀释处理。
（4）如果观察到上图所示 a、b、c、d、e 5 个中格内共有酵母菌 48 个，则上述 1mL 酵母菌样品中约有酵母菌2.4×108个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？多次计数，求平均值。
（5）计数完毕，取下盖玻片，用清水将血球计数板冲洗干净， 不能 （填写 能或不能）用硬物洗刷。
解析：（1）①应将试管轻轻震荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养③应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据（2）为了保证计数准确，不受其它杂菌的影响，应该灭菌处理。（3）如果小格内酵母菌较多，应该稀释处理。（4）如题，所用规格为1mm×1mm×0.1mm，25×16的计数板，所以a、b、c、d、e 5 个中格内共计80个小格内含有48个酵母菌。那么计数室内400个小格，酵母菌的数量为240个，即0.1mm3内含有240个酵母菌，又因为计数前酵母菌液稀释了100倍。因此可以推算出1mL内含有2.4×108个酵母菌。其实也可以用上文提到的公式直接带入计算:细胞个数/1mL=每个小方格细胞数目的平均值×400×104×稀释倍数=48/80×400×104×100=2.4×108。要获得较为准确的数值，减少误差，多次计数，求平均值。（5）为防止硬物洗刷或抹擦损坏计数室网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干，放入盒内保存。
6 血球计数板使用注意事项
（1）血球计数板计数法的缺点是不能区分死菌和活菌，因此计数结果与待测样品中实际含菌数量相比往往偏高。为了避免把死菌计数在内，可以对待测菌体用台盼蓝染色，被染成蓝色的，为死菌。反之，为活菌；
（2）应将试管轻轻震荡或倒转几次再吸取酵母菌培养液进行计数；
（3）若培养一段时间后而密度过大，计数前要进行稀释一定的倍数；
（4）压在方格线上的细胞只计左线和上线的细胞，目的是防止重复计数；
（5）酵母细胞若有黏连，要数出团块中的每一个细胞；
（6）出芽酵母的芽体体积若超过细胞体积的1/2，则算作独立的个体；
（7）计数总数不少于300个细胞；
（8）计数时应不时地调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。
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